作者：Mark Webber1，Elaine Humphrey2
1 加拿大BC省加利亞諾島(Galiano?Island)硅藻資深研究員
2 美國顯微學會會士，前加拿大顯微學會主席，現(xiàn)任加拿大維多利亞大學高級顯微鏡中心項目經(jīng)理
現(xiàn)有方法存在哪些問題？
硅藻殼面和殼環(huán)帶面（即帶面）的顯微形態(tài)是屬、種水平硅藻鑒定的重要依據(jù)。常規(guī)掃描電鏡（SEM）觀察硅藻樣品的方法是將硅藻樣品去有機質處理后置于平整載體（如玻片、掃描電鏡樣品座、碳導電膠、濾膜等）上觀察，其缺點是：
- 通常僅能觀察到硅藻一個角度（殼面方向或帶面方向）上的結構，而該角度多數(shù)情況下不是拍攝硅藻照片或鑒定硅藻種類的理想方向（見圖1）；
- 為滿足鑒定要求，需尋找角度理想的硅藻或者傾斜和旋轉樣品座、調節(jié)電鏡參數(shù)以觀察硅藻不同方向上的結構（實際上仍難獲得理想的拍攝角度），而這些過程需花費大量的時間。
常規(guī)光鏡（LM）觀察方法同樣存在上述缺點。
圖1 顯示了使用表面平整的鋁樣品座觀察硅藻的局限性
（a）一種羽紋綱淡水硅藻，僅能觀察到殼面結構，即使完全傾斜樣品座，也不能看到帶面結構，比例尺=5μm
（b）一種海洋硅藻-骨條藻（Skeletonema sp.），僅能觀察到帶面結構，即使傾斜樣品座，也不能看到殼面結構，比例尺=10μm
解決方法
利用鉆石刻刀在掃描電鏡鋁樣品座上劃網(wǎng)格，然后讓硅藻樣品隨機地以不同角度落在樣品座表面及所刻的槽內，籍此在光鏡和掃描電鏡下能快速地獲得硅藻種類鑒定所需的殼面和帶面結構信息。
具體過程
1、 在鋁樣品座上刻槽
2)? ?用雙蒸水（DDW）去除殘留的碎屑；
3)? ?將樣品座固定于圖2a所示的夾具內；
4)?? 以鋼尺為標尺，持圖2a-c所示的鉆石刻刀在樣品座上刻網(wǎng)格狀的槽（圖2d-f），槽的寬度為20-125μm，槽之間的間隔小于1mm；注意刻槽時，鉆石刻刀與樣品座表面垂直，控制好力度使所刻槽的寬度、深度均勻，滿足硅藻觀察的需要；
5)?? 用潤濕后的1200目碳化硅砂紙輕輕打磨樣品座，去除刻槽過程中產(chǎn)生的棱角；
6)?? 將樣品座放入肥皂液中刷洗，再用雙蒸水淋洗；
7)?? 待樣品座干后，利用硬工作臺上折疊放置的紙巾將樣品座表面拋光；或者用14000目（1-2μm）的金剛砂輪或金剛砂片拋光；
8)?? 用100%的乙醇清洗樣品座；
按上述過程制作一個樣品座，大約需6-10min。
2、 放置硅藻樣品
2)?? 洗滌：用足量的雙蒸水去除清潔過程中所使用的鹽（例如，使用家庭用漂白劑清潔，容易在樣品座和樣品上產(chǎn)生大量的鹽，雙蒸水用量為100-150mL；用過氧化氫清潔，產(chǎn)生的鹽少，雙蒸水用量相應減少）；
3)?? 離心：1600rpm轉速下離心30-40min，對于堅硬的圓篩藻屬，可在3000rpm轉速下離心30min，而對于纖弱的雙尾藻屬，最好采用自然沉降的方法，沉降時間為2h以上；
4)?? 加雙蒸水或雙蒸水/乙醇混合液（50–80%乙醇），吸取硅藻懸浮液滴在樣品座上，使用乙醇混合液的好處在于：無需使用烘箱，減少樣品干燥時間；促進樣品運動，避免堆積，增大硅藻以不同角度沉積在樣品座上的概率；
5)?? 自然干燥，過夜。（如使用烘箱，則在60°C下放置10-15min）；
6)?? 在立體顯微鏡下檢查硅藻位置、數(shù)量及分布情況，為滿足電鏡觀察的要求，硅藻數(shù)量應足夠多，且無堆疊現(xiàn)象；
7)?? 鍍膜：在樣品座上鍍Au/Pd或Au膜，厚度為8-15nm，以提高SEM觀察時的信噪比，避免荷電現(xiàn)象發(fā)生；
8)?? 掃描電鏡觀察、拍照。
圖2 在SEM鋁樣品座上刻槽
（a）夾具，鋼尺，刻槽
（b）鉆石刻刀
（c）刀尖
（d）刀尖角度
（e）常規(guī)的SEM鋁樣品座
（f）網(wǎng)格狀凹槽
結果展示
如圖3-圖7所示。
圖3
（a）分散在網(wǎng)格狀樣品座上的海鏈藻（Thalassiosira punctigera），比例尺=75μm
（b）無需傾斜SEM樣品臺，a中心的2個海鏈藻（Thalassiosira punctigera），比例尺=20μm
（c）分散在凹槽內的布氏雙尾藻（Ditylum brightwellii）（箭頭方向），凹槽寬度為70–125μm，凹槽之間的間距為200–800μm，比例尺=500μm
（d）c中凹槽內的布氏雙尾藻，其殼面朝上，單箭頭指向硅藻位置，雙箭頭顯示凹槽的寬度為73μm，比例尺=20μm
圖4
（a）中心綱盒形藻（Biddulphia antediluviana）立體顯微鏡照片，殼面和帶面結構均可見，比例尺=75μm
（b）凹槽內的中心綱盒形藻（Biddulphia antediluviana）帶面方向的SEM照片，比例尺=10μm
圖5
（a-b）凹槽內的海洋硅藻-骨條藻（Skeletonema sp.），殼面和帶面結構均可見，黑色箭頭顯示凹槽寬度為176μm，a、b中的比例尺分別為20μm、10μm
圖6
（a）凹槽內的卵形藻（Cocconeis sp.），殼面朝上
（b）卵形藻（Cocconeis sp.）的內部結構，需略微傾斜SEM樣品臺，比例尺=20μm
圖7?立體顯微鏡拍攝的硅藻照片，比例尺均為100μm
（a）中心綱海鏈藻（Thalassiosira sp.），角度特殊，可見帶面結構
（b）凹槽內的海洋硅藻-具槽帕拉藻（Paralia sulcata），殼面、帶面結構均可見
結論
該方法使用具有網(wǎng)格狀凹槽的樣品座，簡單、快速、經(jīng)濟，與使用平整載體的常規(guī)方法相比，更有利于全面觀察硅藻顯微形態(tài)。
（翻譯：胡孫林）
原文鏈接：
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